去除無(wú)外泌體血清|進(jìn)口

貨號(hào)：EXO-FBS-50A-1

品牌：SBI

規(guī)格：50ml

當(dāng)外泌體在1980年被發(fā)現(xiàn)后，其被認(rèn)為是細(xì)胞排泄廢物的一種方式，如今隨著大量對(duì)其生物來(lái)源、其物質(zhì)構(gòu)成及運(yùn)輸、細(xì)胞間信號(hào)的傳導(dǎo)以及在體液中的分布的研究發(fā)現(xiàn)外泌體具有多種多樣的功能。外泌體的功能取決于其所來(lái)源的細(xì)胞類型，其可參與到機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等方方面面。有研究表明腫瘤來(lái)源的外泌體參與到腫瘤細(xì)胞與基底細(xì)胞的遺傳信息的交換，從而導(dǎo)致大量新生血管的生成，促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)與侵襲。

外泌體——基礎(chǔ)知識(shí)篇

細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）是指細(xì)胞主動(dòng)分泌的具有膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡的統(tǒng)稱，幾乎所有的細(xì)胞都會(huì)分泌EVs，然而EVs最初被認(rèn)為是細(xì)胞向外排泄的“垃圾"，是細(xì)胞移除碎片和清除特定大分子的一種途徑。根據(jù)大小、生物特性和形成過(guò)程的不同，EVs主要分為外泌體（exosomes）、微囊泡（microvesicles）、和凋亡小體（apoptotic bodies）三大類。近十年來(lái)，研究學(xué)者重新認(rèn)識(shí)了EVs的重要性，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)EVs可以作為遺傳信息的傳遞者，攜帶和傳遞信號(hào)分子運(yùn)輸?shù)较噜忂h(yuǎn)處的細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理和病理的狀態(tài)，參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其中對(duì)于外泌體的研究最為火熱。

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外泌體——研究思路篇

01外泌體的樣本來(lái)源

由于研究細(xì)胞分泌的外泌體，需要避免培養(yǎng)基中其它外源性外泌體對(duì)細(xì)胞分泌外泌體的影響，目前采用以下方法獲取研究樣本：血清饑餓培養(yǎng)、去外泌體血清培養(yǎng)、無(wú)血清體系培養(yǎng)、其它樣本來(lái)源。

01血清饑餓培養(yǎng)

一般是指通過(guò)降低培養(yǎng)液中的血清濃度，使所培養(yǎng)的細(xì)胞因缺乏血清中的生長(zhǎng)因子而不能分裂，這個(gè)操作常用來(lái)做細(xì)胞同步化分裂。常規(guī)操作就是在細(xì)胞培養(yǎng)至融合度為50-60%左右，撤去含血清的*培養(yǎng)基，更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)細(xì)胞至融合度為80%左右，收獲細(xì)胞上清進(jìn)行下游的研究。但血清饑餓培養(yǎng)收獲的外泌體量有限且質(zhì)量較低。

02去外泌體血清培養(yǎng)

為了減少或避免血清饑餓培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞分泌外泌體的影響，去外泌體血清培養(yǎng)細(xì)胞成為大多數(shù)學(xué)者選擇的一種方式。去外泌體血清可適用于大部分細(xì)胞培養(yǎng)，基本可維持與正常胎牛血清中相同生長(zhǎng)速率和形態(tài)。在使用各種方法去除胎牛血清中大部分的外泌體后添加至培養(yǎng)基中配制成去外泌體血清*培養(yǎng)基，應(yīng)用于細(xì)胞外泌體的研究。

03無(wú)血清體系培養(yǎng)

從饑餓培養(yǎng)到去外泌體血清培養(yǎng)，再到無(wú)血清體系培養(yǎng)。這是針對(duì)外泌體研究所做出的培養(yǎng)基改善與優(yōu)化。也讓學(xué)者們能夠了解到細(xì)胞培養(yǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)成分。目前無(wú)血清體系的培養(yǎng)基可分為含血小板裂解物（含外泌體）的無(wú)血清培養(yǎng)基、配方明確的無(wú)血清培養(yǎng)基等，其中配方明確的無(wú)血清體系讓研究細(xì)胞外泌體的結(jié)果更加準(zhǔn)確。

04其它外泌體樣本的來(lái)源

除了細(xì)胞來(lái)源的外泌體樣本研究最為廣泛，血漿、血清也是多數(shù)學(xué)者的研究樣本，其它的樣本包括唾液、腦脊液、乳汁、尿液等生物體液，均可以作為外泌體研究的樣本來(lái)源。

HeLa 人宮頸癌細(xì)胞

143B 人骨肉瘤細(xì)胞

293T 人胚腎細(xì)胞

A2780 人卵巢癌細(xì)胞

A549 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

A673 人尤因肉瘤細(xì)胞

AGS 人胃腺癌細(xì)胞

BGC823 人胃腺癌細(xì)胞(低分化)

C33A 人宮頸癌細(xì)胞

CACO2 人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞

COLO205 人結(jié)腸癌細(xì)胞

DU145 人前列腺癌細(xì)胞

ES-2 人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞

H1650 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

H460 人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞

HACAT 人永生化表皮細(xì)胞

HCT116 人結(jié)腸癌細(xì)胞

HEK-293 人胚腎細(xì)胞

HEPG2 人肝癌細(xì)胞

HGC-27 人胃癌細(xì)胞(未分化)

HT-29 人結(jié)腸癌細(xì)胞

t24 人膀胱癌細(xì)胞

KYSE150 人食道癌細(xì)胞

L02(HL7702)(QSG-7701)(7402)(bel7404) 人正常肝細(xì)胞

LOVO 人結(jié)腸癌細(xì)胞

MCF-10A 人正常乳腺上皮細(xì)胞

MCF7 人乳腺癌細(xì)胞

LX-2 人肝星狀細(xì)胞

MDA-MB-468 人乳腺癌細(xì)胞

MIA Paca2 人胰腺癌細(xì)胞

NCI-H1299 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

PANC-1 人胰腺癌細(xì)胞

RBE 人肝膽管癌細(xì)胞

SAOS-2 人成骨肉瘤細(xì)胞

SiHa 人子宮頸鱗癌細(xì)胞

NB 4 急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞

SPC-A-1 人肺腺癌細(xì)胞

SW480 人結(jié)腸癌細(xì)胞

U-87MG 人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞

ZR-75-1 人乳腺癌細(xì)胞

SW1116 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞

293A 人胚腎細(xì)胞

SGC-7901 人胃腺癌細(xì)胞

Ishikawa 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞

Eca-109 人食管癌細(xì)胞

RD-ES 人尤文氏肉瘤

NCI-H1437 人肺癌細(xì)胞

HOS 人骨肉瘤細(xì)胞

Hela S3 人宮頸癌細(xì)胞

ECC1 人宮頸內(nèi)膜腺癌細(xì)胞

SUP-B15 人Ph+急淋白血病細(xì)胞系

TF-1 人血液白血病細(xì)胞

NCI-H446 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

GES-1 人胃正常黏膜上皮細(xì)胞

IOSE80 人卵巢正常上皮細(xì)胞株

sw-13 人腎上腺皮質(zhì)小細(xì)胞癌細(xì)胞

KGN 人卵巢顆粒細(xì)胞癌

U937 人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞

SV-HUC-1 人膀胱上皮永生化細(xì)胞

tpc-1 人乳頭瘤狀甲狀腺癌細(xì)胞

hela-luci Luciferase穩(wěn)定表達(dá)Hela細(xì)胞

colo320 人結(jié)腸癌細(xì)胞

bxpc-3 人胰腺腺癌細(xì)胞

raji 人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞

5637 人膀胱癌細(xì)胞

chang-liver 人肝細(xì)胞(已被hela污染）

a549-gfp gfp標(biāo)記的A549細(xì)胞

hs578.t 人乳腺癌細(xì)胞

T24 人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞

K562 人慢性髓系白血病細(xì)胞

EH-GB1 人膽囊癌細(xì)胞

skov-3 人卵巢腺癌細(xì)胞

ECV304 人膀胱癌細(xì)胞（T24衍生物）

nci-n87 人胃癌細(xì)胞

B-CPAP 人甲狀腺癌細(xì)胞

NCI-H1975 人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞

HK-2 人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞

J82 人膀胱癌細(xì)胞

A431 人皮膚鱗癌細(xì)胞

MG63 人骨肉瘤細(xì)胞

SW48 人結(jié)腸癌細(xì)胞

ME180 人宮頸表皮樣癌

hepaRG-GFP Gfp標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞

BEAS-2B 人正常肺上皮細(xì)胞

THP-1   人髓系白血病單核細(xì)胞

PC-9 人肺癌細(xì)胞

Fadu 人咽鱗癌細(xì)胞

Huh7 人肝癌細(xì)胞

HCCC9810 人肝癌細(xì)胞

Jurkat cloneE6-1 人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞

KBM-7 人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞

GBC-SD 人膽囊癌細(xì)胞

JEKO-1 人套細(xì)胞淋巴癌細(xì)胞

CAL-27 人口腔鱗癌

DB 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞

mp38

nci-h226 人肺鱗癌細(xì)胞

hepg2.2.15 人肝癌細(xì)胞

SK-BR-3 人乳腺腺癌細(xì)胞

SNU-1 人胃癌細(xì)胞

su-dhl-6 人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞

HL-60 人早幼粒急性白血病細(xì)胞株

nk-92mi 人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞

kg-1 人急性骨髓性白血病細(xì)胞

nci-h209 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

sk-hep-1 人肝癌細(xì)胞

sw579 人甲狀腺鱗癌細(xì)胞

nthy-ori-3-1 人甲狀腺正常細(xì)胞

bt474 人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞

ncm460 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞

hmec-1 人微血管內(nèi)皮細(xì)胞

mrc5 人胚肺細(xì)胞株

t2 (atcc) 人T2細(xì)胞

22rv1 人前列腺癌細(xì)胞

hct8 人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞

786-o 人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞

SKOV3-GFP 轉(zhuǎn)染GFP的人卵巢癌細(xì)胞

RKO 人結(jié)腸癌細(xì)胞

calu-1 人肺癌細(xì)胞

kb 人口腔表皮樣癌細(xì)胞

ovcar3 人卵巢腺癌細(xì)胞

u937-dc-sign 人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞

a375 人惡性黑色素瘤瘤株

u2OS 人成骨肉瘤細(xì)胞

h69ar 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

sk-mel-28 人皮膚惡性黑色素瘤

95D 人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞

nci-h226 人肺鱗癌細(xì)胞

calu3 人肺腺癌細(xì)胞

C666-1 人鼻咽癌細(xì)胞

HT1080 人纖維肉瘤細(xì)胞

ASPC-1 人胰腺癌細(xì)胞

TT 人髓樣甲狀腺腫瘤細(xì)胞

NOZ 人膽囊癌細(xì)胞

HCCLM3 人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞

mda-mb-453 人乳腺癌細(xì)胞

TFK-1 人膽管癌細(xì)胞

FHs 74 Int 人小腸上皮細(xì)胞

H9胚胎干細(xì)胞 人胚胎干細(xì)胞

caki-2 人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞

mda-mb-231 人乳腺癌細(xì)胞

pc3 人前列腺細(xì)胞

去除無(wú)外泌體血清|進(jìn)口

如何鑒定提取出來(lái)的外泌體？

以目前外泌體的分離手段很難獲得十分純凈而且單一的外泌體樣品，也沒有任何一個(gè)單一實(shí)驗(yàn)可以確定外泌體的存在。根據(jù)國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)發(fā)表的指導(dǎo)手冊(cè)《MISEV 2018》，外泌體特征鑒定通過(guò)NTA測(cè)粒徑分布、TEM電鏡分析形態(tài)、WB檢測(cè)標(biāo)志蛋白三項(xiàng)來(lái)驗(yàn)證。NTA分析樣品中外泌體的粒徑分布和顆粒濃度，TEM電子顯微鏡來(lái)觀察樣品中外泌體的形態(tài)特征，WB檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白。

外泌體如何保存？

不同時(shí)間、溫度的保存對(duì)不同的外泌體樣本影響不一；如果研究方向?yàn)橥饷隗w形態(tài)特征、蛋白或其他功能性分析，在分離后新鮮使用為最佳。目前主流的建議是提取出外泌體后最好是新鮮使用，或低溫短期保存。

短時(shí)間幾天內(nèi)可以放4°C，長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存置于-80°C保存。

NTA檢測(cè)可以進(jìn)行外泌體定量嗎？

NTA是物理方法，基于顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)，因?yàn)椴还苁侵|(zhì)體、蛋白，甚至是PBS中的顆粒（部分實(shí)驗(yàn)室自行配置的PBS中發(fā)現(xiàn)大量顆粒，推薦在外泌體研究中，用VC品牌的PBS（P/N:C3580-0500），避免干擾），都會(huì)被軟件讀取，并不能分辨是否為外泌體。但NTA提供的粒徑分布可供判斷所提取的內(nèi)含物是否在外泌體的粒徑范圍內(nèi)；另外，在做外泌體分泌的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，NTA提供的濃度值也可以作為重要的參考數(shù)據(jù)。

外泌體NTA檢測(cè)需要多少量？

Zetaview儀器的最佳檢測(cè)區(qū)間是10^7 particles/ml，且有濃度檢測(cè)下限，為10^5 particles/ml，一般進(jìn)樣量不少于2 ml；

無(wú)法準(zhǔn)確建議送樣量，檢測(cè)需要量與樣本本身濃度有關(guān)，樣本濃，則用量小，反之則多，根據(jù)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，樣本取用量一般在2 µl-100 µl不等，取用量大于50 µl時(shí)大多由于樣本分泌量過(guò)低、提取失敗或者對(duì)樣本有過(guò)多稀釋。

一般建議：送樣量不低于30 µl。

外泌體用什么分離方法比較好？

無(wú)法明確哪種分離方法比較好，各有千秋，以下列出常用的外泌體分離方法：

超速離心法（差速離心和密度梯度離心）：操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，分離外泌體純度較高，但得率低，目前分離外泌體主流方法；

尺寸排阻色譜（Size-exclusion chromatography，SEC）：應(yīng)用填充多孔聚合物微球的柱子，精確分離大小分子，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，分離外泌體純度較高；

聚合物沉淀法：操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，可能會(huì)同時(shí)分離非囊泡污染物（包括脂蛋白），分離外泌體純度較低；

磁珠免疫法：通過(guò)特定的抗體組合從樣本中捕獲不同類型的外泌體，免疫親和技術(shù)具有高特異性、可獲得高純度的外泌體、且不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點(diǎn)，是富集表征*的外泌體的優(yōu)選方法。但是此方法效率低，外泌體內(nèi)含物的生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

組合方法：如聚合物沉淀法+SEC (CellGS Exo-spin 外泌體純化試劑盒）純化流程溫和，無(wú)需高速離心，操作簡(jiǎn)便并且產(chǎn)物純度高，分離出的外泌體完好無(wú)缺，適用于下游功能研究、WB驗(yàn)證、RNA分析等。