貨號：WS010-100-KIT

品牌：WinSera

規(guī)格：100ml

操作步驟：
1、 原代

(1)取材后的肝癌組織須在 2 - 8℃含有組織保存液E的取樣瓶中，快速轉(zhuǎn)運(yùn)至潔凈實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織處理和干細(xì)胞分離，拍照并登記信息。

(2)準(zhǔn)備若干培養(yǎng)皿，加入 4℃預(yù)冷的肝癌類器官培養(yǎng)緩沖液 B備用

(3)取樣瓶消毒，將組織放入培養(yǎng)皿中，利用肝癌類器官培養(yǎng)緩沖液B清洗三次后，利用眼科剪或手術(shù)刀將腫瘤組織剪切成體積約為 1~3 mm3 的組織塊。

(4)組織用肝癌原代組織消化液C消化，37℃震蕩消化10-20 min，（消化過程中隨時(shí)觀察消化情況）。

(5)取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個(gè)細(xì)胞或 70μ m 以下的細(xì)胞簇后，加入三倍體積肝癌類器官培養(yǎng)緩沖液B終止消化。

(6)使用100μm孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，將濾液收集后，于300g富集離心5min后移去上清，添加肝癌類器官培養(yǎng)緩沖液B重新重懸離心。

(7)基質(zhì)膠計(jì)算：第6步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠重懸鋪板。

(8)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點(diǎn)膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進(jìn)行鋪板（4℃下操作）。

(9)將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加肝癌類器官培養(yǎng)基A（恢復(fù)室溫）進(jìn)行培養(yǎng)。

2、 類器官傳代培養(yǎng)

(1)移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液B放置2min。

(2)移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）

(3): 3.1類器官數(shù)量不足或體積較小時(shí)： 離心5min棄去上清，添加適量肝癌類器官緩沖液B重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進(jìn)行第4步。 3.2類器官數(shù)量較多或體積較大時(shí)：離心5min棄去上清，添加適量類器官傳代消化液D消化2-3min，添加肝癌類器官緩沖液B終止消化，離心5min棄去混合液，添加適量肝癌類器官緩沖液B重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進(jìn)行第4步。

(4)類器官收集后，添加基質(zhì)膠重懸，每孔25μl基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中10-15min添加500μl肝癌類器官培養(yǎng)基A。

3、類器官凍存

(1)移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液B放置2min。

(2)移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）

(3) 離心5min棄去上清，添加適量肝癌類器官緩沖液B再次重懸，300g離心5min棄去液體。

(4)添加適量類器官凍存液 F，輕柔吹打重懸，以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例：密度為2個(gè)孔凍存1管，每管體積1.4ml。

(5)做好標(biāo)記信息，進(jìn)行程序降溫后，移入液氮長期保存，

4、 類器官復(fù)蘇

(1)取10ml肝癌類器官培養(yǎng)緩沖液B于15ml離心管中

(2)從液氮罐中取出凍存的類器官細(xì)胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。

(3)水浴融解過程中，需輕輕搖動(dòng)冷凍管，以確保凍存液在 1-2 分鐘內(nèi)w全融解。

(4)將溶解后的類器官細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移至15ml 離心管，使用移液管輕輕吹打6-8次，300g 離心 5分鐘，然后除去上清液并收集類器官細(xì)胞沉淀。添加適量肝癌類器官緩沖液B重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。

(5)基質(zhì)膠重懸，每孔25μl基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加500μl肝癌類器官培養(yǎng)基A。

運(yùn)用范圍:

FOR LABORATORY RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES

培養(yǎng)圖片展示:

送樣要求及癌種

樣本的質(zhì)量將極大影響類器官培養(yǎng)的成功率和效率，因此建議客戶提供的樣本需符合以下幾項(xiàng)要求：