1. 血清沉淀是什么？   

血清中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀，其成分有多種類型，產(chǎn)生的原因有很多。主要有纖維蛋白（絮狀沉淀）、甲胎蛋白、脂蛋白、冷凝集素、玻粘連蛋白、磷酸鈣（顯微鏡下小黑點(diǎn)沉淀）、膽固醇等。

纖維蛋白（Fibrin）

血清中肉眼可見(jiàn)的沉淀物大多屬于這一類型。由于在生產(chǎn)過(guò)程中，血清采集、過(guò)濾（3 次 0.1μm過(guò)濾）和灌裝處理都是在低溫條件下快速完成, 此時(shí)血清中纖維蛋白原（Fibrinogen）處于溶解狀態(tài)。但在解凍之后, 血清中纖維蛋白原往往會(huì)發(fā)生凝集，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀。

磷酸鈣（Calcium Phosphate）

這是一種常見(jiàn)的沉淀成分，通常會(huì)造成血清出現(xiàn)云霧狀渾濁。當(dāng)血清在 37℃保存時(shí)，這種現(xiàn)象尤其明顯，在倒置顯微鏡下可觀察到小黑點(diǎn)的存在。這些小黑點(diǎn)在布朗運(yùn)動(dòng)的作用下四處游動(dòng)，常被誤認(rèn)為是微生物污染。

其他成分（Other）

血清中的其他成分也會(huì)形成沉淀，例如膽固醇形成的油脂滴和其他蛋白沉淀等。

2. 沉淀是如何形成的？            

造成沉淀的主要原因是溫度的改變、熱滅活、反復(fù)凍融、長(zhǎng)期儲(chǔ)存于2-8℃或者室溫。

3. 血清沉淀會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)嗎？

我們?cè)诔鰪S前都會(huì)對(duì)血清進(jìn)行一系列質(zhì)檢測(cè)試，確保血清質(zhì)量達(dá)到嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。血清測(cè)試和細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)也表明，其沉淀成分不會(huì)影響血清作為細(xì)胞培養(yǎng)添加物的表現(xiàn)。這一點(diǎn)得到了眾多用戶和其他血清供應(yīng)商的肯定。解凍之后, 血清中纖維蛋白原往往會(huì)發(fā)生凝集，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀。

磷酸鈣顆粒經(jīng)常會(huì)被當(dāng)成微生物污染而引發(fā)不必要的擔(dān)憂。一般情況下，當(dāng)操作人員融化血清后注意到有霧狀渾濁時(shí)，常將其存放在 4℃冰箱中觀察，并考慮接下來(lái)是否繼續(xù)使用。但這樣會(huì)使沉淀進(jìn)一步增多，反而會(huì)使血清更加渾濁，進(jìn)而誤以為存在血清污染。并且，在倒置顯微鏡下，可在血清中觀察到小黑點(diǎn)（磷酸鈣顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)），更容易使人誤以為存在微生物污染。

為防止這類誤解的產(chǎn)生，我們不建議用戶培養(yǎng)血清來(lái)驗(yàn)證是否存在污染，而是將血清直接接種在細(xì)菌培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以觀察是否有細(xì)菌的增殖。并且，進(jìn)行革蘭氏染色，并在油鏡（100 X 10 倍）下觀察可直接確認(rèn)是否存在微生物污染。

WinSera血清采用先進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過(guò)3次0.1μm過(guò)濾，有效去除霉菌、細(xì)菌、酵母菌、支原體等，并通過(guò)ISO13485質(zhì)量體系認(rèn)證。

4. 如何避免血清沉淀                

正確解凍

首先，應(yīng)按照逐步解凍的方式正確解凍血清：從-20℃取出后，置于4℃冰箱緩慢解凍，最后置于室溫完成解凍。如果直接從-20℃拿到室溫或37℃水浴解凍，則非常容易產(chǎn)生沉淀。在解凍過(guò)程中，請(qǐng)注意，應(yīng)時(shí)不時(shí)緩慢搖晃血清瓶，可減少沉淀的產(chǎn)生。為避免反復(fù)凍融，建議您將血清分裝使用。

使用和保存注意事項(xiàng)

血清沉淀很難預(yù)測(cè)和避免，出現(xiàn)沉淀后也無(wú)需擔(dān)憂，這并不會(huì)影響血清的品質(zhì)。已知血清沉淀在以下條件下會(huì)有增多的可能：

1) 熱滅活；

2) 37℃培養(yǎng)；

3) 反復(fù)凍融；

4) 伽馬射線照射；

5) 2-8℃長(zhǎng)期保存；

6) 長(zhǎng)期保存于可自動(dòng)化霜的冰箱中（溫度不穩(wěn)定）；

血清沉淀的形成機(jī)理多種多樣，具體的機(jī)理尚不十分明確。我們尚不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和控制血清沉淀的產(chǎn)生。目前市面上所有品牌的血清產(chǎn)品都存在沉淀現(xiàn)象，這一點(diǎn)可以在各品牌網(wǎng)站上關(guān)于沉淀問(wèn)題的聲明上得到證實(shí)。

5. 有沉淀時(shí)如何處理？             

我們建議您采用2000rpm離心5分鐘，取上清使用就好，比過(guò)濾方便，不需要另外準(zhǔn)備濾芯和針筒，且不容易污染。

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血清產(chǎn)品中出現(xiàn)沉淀屬于正?，F(xiàn)象，不會(huì)影響到血清的品質(zhì)，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)也不會(huì)產(chǎn)生影響，大家可以放心使用，若不立即使用，血清應(yīng)保存在-20℃以下。

在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，我們經(jīng)常會(huì)聽(tīng)到一些專業(yè)名詞，原代培養(yǎng)是什么？什么是世代數(shù)？細(xì)胞系是什么？有限細(xì)胞系又代表的是什么？有的專有名詞搞不清楚的話，會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程也會(huì)有一定的影響。根據(jù)老師們的反饋，我們總結(jié)了以下容易混淆的概念供大家參考~

1原代培養(yǎng)（Primary culture）

開(kāi)始于直接取自生物體的細(xì)胞、組織或器官的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。通常代表異質(zhì)細(xì)胞群，很難標(biāo)準(zhǔn)化和繁殖。它們的壽命一般有限，而且已知它們會(huì)隨著時(shí)間而改變其差異特征。

2傳代（Passage(Subculture)）

細(xì)胞從一個(gè)皿里轉(zhuǎn)移或傳代到另一皿里的過(guò)程稱為細(xì)胞傳代。這是一個(gè)操作行為，無(wú)法準(zhǔn)確定義細(xì)胞分裂次數(shù)。

3傳代次數(shù)（Passage number）

一種細(xì)胞被傳代培養(yǎng)的次數(shù)稱為傳代次數(shù)。

4世代數(shù)（Generation number）

一種細(xì)胞所經(jīng)歷的細(xì)胞數(shù)量倍增次數(shù)稱為世代數(shù)。

5群體倍增時(shí)間（Population doubling time）

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期細(xì)胞數(shù)量翻倍所需要的時(shí)間間隔稱為群體倍增時(shí)間。

6群體倍增次數(shù)（Population doubling）

在培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞所經(jīng)歷的細(xì)胞數(shù)量倍增次數(shù)稱為群體倍增次數(shù)。

7細(xì)胞系（Cell line）

原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)第一次傳代后增殖的細(xì)胞稱為細(xì)胞系或亞克隆。隨著細(xì)胞的傳代，生長(zhǎng)能力*強(qiáng)的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞群體在基因型和表現(xiàn)型上達(dá)到一定程度的均一性。

8細(xì)胞株（Cell strain）

細(xì)胞系通過(guò)選擇或克隆獲得的具有特征的細(xì)胞系稱為細(xì)胞株。與親代細(xì)胞系起始時(shí)相比，細(xì)胞株往往會(huì)獲得其他一些遺傳學(xué)改變。

9有限細(xì)胞系（Finite cell line）

通過(guò)傳代增殖但在體外只能增殖有限細(xì)胞數(shù)量的一種細(xì)胞稱為有限細(xì)胞系（通常60-70倍增次數(shù)）。

10衰老（Senescence）

與染色體端?？s短相聯(lián)系的生物調(diào)控的增殖潛力損失稱為細(xì)胞衰老。存活的細(xì)胞也可能保留一些功能活性。

11永生化（Immortalization）

獲得無(wú)限的壽命，可能是細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的，也可能是以轉(zhuǎn)染引起的。

12無(wú)限細(xì)胞系（Infinite/immortal/strain）

具有無(wú)限增殖能力的細(xì)胞系或細(xì)胞株稱為無(wú)限細(xì)胞系/連續(xù)細(xì)胞系。

13平板效率（Plating efficiency）

在傳代培養(yǎng)中產(chǎn)生集落的細(xì)胞的百分比稱為平板效率。如果每個(gè)集落都可以說(shuō)是來(lái)自一個(gè)細(xì)胞，那么平板效率等同于克隆效率/集落形成效率。有時(shí)，平板效率被粗略地用來(lái)描述傳代培養(yǎng)后存活的細(xì)胞數(shù)量，但這被更好地稱為種子效率。

導(dǎo)致細(xì)胞污染的原因主要有以下幾方面：

環(huán)境：水浴鍋、培養(yǎng)箱水盤、細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)壁、超凈臺(tái)、桌面及試劑瓶身、細(xì)胞房空氣消毒。

操作：細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存等過(guò)程中也可帶入污染。

試劑：血清、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰酶、輔助試劑、營(yíng)養(yǎng)添加物等。

耗材：培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、槍頭。

細(xì)胞本身：本身攜帶污染、細(xì)胞老化、分化等。

如何進(jìn)行污染源排查？

*血清：其他試劑保持不變，僅更換血清。

*基礎(chǔ)培養(yǎng)基：其他試劑保持不變，僅更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

*PBS：其他試劑保持不變，僅更換PBS。

*胰酶：若細(xì)胞復(fù)蘇的很好，一傳代就污染，可以嘗試其他試劑保持不變，更換消化用胰酶，看細(xì)胞狀態(tài)。

細(xì)胞反復(fù)復(fù)蘇都會(huì)出現(xiàn)污染，那可保持培養(yǎng)體系不變，培養(yǎng)其他類型且適用于此培養(yǎng)體系的細(xì)胞，觀察是否有污染出現(xiàn)。整個(gè)營(yíng)養(yǎng)體系：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、營(yíng)養(yǎng)添加物都可使用控制變量法進(jìn)行排查。

*耗材

培養(yǎng)基及輔助試劑等條件不變，使用新耗材（培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、槍頭）培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞是否有污染。

*細(xì)胞本身

細(xì)胞本身攜帶污染源?？蓪?duì)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)（細(xì)菌、真菌、支原體）。

細(xì)胞分化，細(xì)胞一旦分化，很難逆轉(zhuǎn)，無(wú)法通過(guò)外界營(yíng)養(yǎng)體系和生長(zhǎng)條件的調(diào)整“*”。

*細(xì)胞老化：細(xì)胞一旦老化，是無(wú)法逆轉(zhuǎn)的。

因此，大家需要學(xué)會(huì)觀察細(xì)胞的形態(tài)并進(jìn)行分析，可以按照這幾點(diǎn)進(jìn)行控制變量排查，如若確認(rèn)是細(xì)胞本身問(wèn)題，若細(xì)胞本身不是很昂貴，建議丟掉重新培養(yǎng)，若較珍貴，污染后可嘗試根據(jù)污染種類選擇合適的抗生素進(jìn)行殺滅，分化和老化是沒(méi)有辦法補(bǔ)救的。