外泌體是由細(xì)胞分泌的納米級(jí)膜性小囊泡，直徑約30~150nm。外泌體來(lái)源多樣，廣泛存在并分布于各種生物液體中，富含來(lái)源細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，參與細(xì)胞間的信息交流。不同病理和生理?xiàng)l件下，外泌體的內(nèi)容物不盡相同，因此外泌體可以很好地反映生物體的疾病與健康狀態(tài)。此外，外泌體特殊的膜結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)其內(nèi)容物如RNA（microRNA、mRNA、lncRNA、circRNA）免受酶的降解，保證其能在各類(lèi)體液中被穩(wěn)定檢測(cè)到，因此外泌體是研究各種疾病的良好生物學(xué)材料，可作為腫瘤潛在的biomarker和治療靶點(diǎn)，亦可作為基因/藥物的遞送載體，在疾病的診斷和治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年國(guó)自然中標(biāo)的外泌體相關(guān)項(xiàng)目總計(jì)600多項(xiàng)，總金額高達(dá)2.5億，相較2018年，總金額增長(zhǎng)了44.5%，足可見(jiàn)外泌體研究的火熱程度。近幾年，隨著高通量檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)外泌體進(jìn)行組學(xué)研究極大地推動(dòng)了外泌體的研究進(jìn)展。伯豪生物致力于科研服務(wù)，擁有高標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理平臺(tái)、微陣列芯片平臺(tái)、高通量測(cè)序平臺(tái)、生物標(biāo)志物平臺(tái)、生物信息分析平臺(tái)等多個(gè)平臺(tái)，能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體分離、鑒定、內(nèi)含物（蛋白質(zhì)、mRNA、ncRNA）檢測(cè)及驗(yàn)證的“一站式”外泌體研究服務(wù)。

那么如何開(kāi)展外泌體研究，第一步也是相當(dāng)重要的一步就是收集外泌體含量高的樣本。外泌體存在于各種生物體液中，如血液、乳汁、尿液，腦脊液，那么如何有效的收集各種類(lèi)型的樣本用于后續(xù)的外泌體分離呢，下面我們來(lái)簡(jiǎn)單介紹下各類(lèi)型外泌體樣本的具體收集方法。

注意：收集血清樣本時(shí)一定不能加入抗凝劑。

1) 采集外周血（建議早晨空腹抽血），迅速轉(zhuǎn)入不含EDTA的試管中；

2) 室溫（22℃~25℃）下靜置30分鐘，或4℃下靜置3~4小時(shí)，可見(jiàn)自行凝固；

3) 吸取上清至新的離心管中，4℃，8200×g離心10分鐘；

4) 吸取上清至新的離心管中，4℃，16000×g離心10分鐘；

5) 小心吸取上清至新的離心管中（1.5ml離心管，每管不超過(guò)1ml）， -80℃保存；

6）干冰寄送樣本。

提示：建議送樣量5 mL 以上（大致需全血8-10mL）

血漿

注意：收集血漿樣本用于RNA研究時(shí)一定不要用肝素抗凝管。

1) 采集外周血（建議早晨空腹抽血），迅速轉(zhuǎn)入EDTA抗凝管中，渦旋或顛倒混合5～10 次；

2) 在1小時(shí)（室溫）或2小時(shí)（4℃）內(nèi)進(jìn)行血漿分離，8200×g離心10分鐘；

3) 吸取上清至新的離心管中，4℃，16000×g離心10分鐘；

4) 小心吸取上清至新的離心管中（1.5ml離心管，每管不超過(guò)1ml），-80℃保存；

5）干冰寄送樣本。

提示：建議送樣量5 mL以上（大致需全血8-10mL）

Tips: 血液樣本外泌體研究血清好還是血漿好？

血漿=血液-血細(xì)胞；血清=血漿-纖維蛋白原-凝血因子；血清是血液凝固之后收集的液體，在凝血過(guò)程中血小板會(huì)分泌大量的外泌體，有研究發(fā)現(xiàn)血清中有接近50%的外泌體來(lái)自額外的分泌，所以一般實(shí)驗(yàn)會(huì)選擇血漿。在特殊情況下，如研究與血小板相關(guān)疾病的時(shí)候，血清比血漿更適合。此外，在采血后最好盡快處理樣本，因血液收集到收集管后，血細(xì)胞和血小板會(huì)繼續(xù)分泌外泌體

細(xì)胞上清

注意：細(xì)胞培養(yǎng)基必須使用去除外泌體的血清或者無(wú)血清培養(yǎng)基

1) 正常含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞24h左右，貼壁細(xì)胞密度達(dá)到70%~80%，懸浮細(xì)胞密度達(dá)到60%~70%；

2) 將原有血清培養(yǎng)基更換為去除外泌體的血清或者無(wú)血清培養(yǎng)基（貼壁細(xì)胞直接去除原有培養(yǎng)基，加入適量PBS緩沖液沖洗一次，更換新的培養(yǎng)基；懸浮細(xì)胞4℃，300×g離心10分鐘，收集細(xì)胞后，加入適量PBS緩沖液沖洗一次，更換新的培養(yǎng)基）繼續(xù)培養(yǎng)；

3) 培養(yǎng)48-72小時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量確定收取上清時(shí)間；

4) 4℃，300×g，離心10分鐘收集細(xì)胞上清；

5) 4℃，3000×g，離心15分鐘，確保將細(xì)胞及細(xì)胞碎片去除干凈；

6) 吸取上清，-80℃保存；

7）干冰寄送樣本。

提示：送樣量最好在50 mL 以上，不少于30ml

尿液

1) 收集清晨第一次尿液50ml，注意避免細(xì)菌污染，收集前注意飲食控制，前一晚22:00后禁食禁水；

2) 4 ℃ ，3000×g，離心15分鐘，去除細(xì)胞或細(xì)胞碎片；

3) 收集上清尿液分裝轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，-80℃保存；

4）干冰寄送樣本。

提示：送樣量最好在50 mL 以上

腦脊液

1) 收集腦脊液，收集過(guò)程中避免血液污染；

2) 3000×g，離心15分鐘，去除細(xì)胞或細(xì)胞碎片；

3) 收集上清，-80℃冰箱中保存；

4）干冰寄送樣本。

提示：送樣量最好在20 mL 以上

注：以上建議的送樣量綜合考慮了外泌體的表征檢測(cè)（TEM、NTA、WB）和組學(xué)研究（轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組）的樣本需求量。上述細(xì)胞上清送樣量主要指常規(guī)腫瘤細(xì)胞，對(duì)于其他類(lèi)型細(xì)胞，最好在送樣前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定外泌體含量。

目前外泌體的分離方法中應(yīng)用廣泛的是超速離心法和試劑盒抽提法，超速離心法是外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn)，是高分文章常用的分離方法，獲得的外泌體純度高。其原理主要是依據(jù)外泌體與其他微小囊泡密度和大小的不同而分離，通過(guò)逐步提高離心速度，有效去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大囊泡，收集高純度的外泌體。外泌體抽提試劑盒分離外泌體省時(shí)省力，外泌體純度高，SBI外泌體抽提試劑盒，樣本需求量少，最少可從100ul血清或5ml細(xì)胞上清中分離外泌體。利用超離或試劑盒法分離獲得的外泌體，經(jīng)表征檢測(cè)確定后即可進(jìn)行后續(xù)的組學(xué)研究。

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